为什么生物制品要做强制降解试验??怎么做(2)
聚集,本质上可以是非共价的,例如在合适的条件(例如溶剂,温度)下可解离的单体之间的结合。这些非共价聚集体主要是通过分子的变性和展开,或者是通过与诸如液-气,液-固,甚至液-液的界面相互作用而形成的。这些关联通常是机械应力(例如摇动,搅拌,旋转,泵)的结果,反复冻融、加热、或暴露于酸性pH环境中也会产生聚集。
聚集本质上也可以是共价的,例如分子之间的化学键合,并且在缓冲液更换期间不可解离。这些化学键通常由重排的二硫键或其他改变的分子内化学键链接形成。它们通常是氨基酸残基与微量金属(铜或铁)反应或蛋白质还原不完全的结果。
蛋氨酸,半胱氨酸,组氨酸,色氨酸或酪氨酸残基的侧链易于氧化,其中蛋氨酸是最容易发生反应的残基。氧化可以改变蛋白质的物理化学性质,例如折叠和亚基缔合。氧化条件的形成主要是由于暴露在大气中的氧气,在光,热,湿气,搅动或暴露于氧化剂的条件下而形成的。脱酰胺作用是天冬酰胺或谷氨酰胺的水解转化为游离的羧酸残基,通常是由于冻干蛋白的pH,离子强度,温度和湿度的变化。对单个氨基酸残基进行化学修饰的总体效果取决于其在蛋白质中的位置以及残基在蛋白质的功能性和活性位点中的特定作用。
通过暴露于光照进行的光照光解反应涉及和影响了许多官能团(例如羰基)的自由基,自由基可导致氧化,聚集或肽键裂解。光照分解是由于暴露于一定的光照辐射中引起的,该光辐照通常是以紫外线辐照的形式体现的。
水解(裂解)是氨基酸残基之间的肽键断裂,释放较小的肽链。Asp-Pro和Asp-Gly的肽键最容易水解。水解主要是由于暴露于酸性或碱性pH值引起的。
二硫键交换可能导致不正确的二硫键配对,从而影响蛋白质的三级结构。这种不正确的二硫键可能是由于变性或者还原条件(暴露于试剂,如GnHCl,尿素和1,4-二硫苏糖醇DTT)和半胱氨酸残基的氧化而导致的二硫键部分裂解和重整的结果被铜(II)或铁(II)离子氧化。
几种生物制品包含配体或结合物,由于分子上的化学或物理应力,此类结合的部分(例如,酰化和缀合)可能会丢失。
选择用于强制降解研究的材料
在开展强制降解研究时,使用的试验样品非常重要。强制降解研究由于所涉及的条件多检测量大,通常需要大量的试验样品。但是,只要选择合适的试验样品就可以,样品可以是在非GMP条件下生产的样品,也可以是测试批次生产的样品,甚至也可以使用不合格的批次进行试验(如果有的话)。
所有相关样品类型均应包括在强制降解研究中。对于特定于药品的方法,可以包括高剂量和低剂量的药品。如果分子被修饰(例如,通过酰化,糖基化或缀合),则强烈建议包含中间体,以帮助理解分子底层结构中的变化。包括溶液/缓冲液空白和对照(赋形剂),用于评估因降解压力条件而出现的新结果的峰轮廓。在每个实验中应该始终包括参考样品。
选择用于强制降解研究的分析方法
由于生物制品的复杂性,没有一种能够表明其所有稳定性特征的稳定性指示方法。生物药物的性质将决定使用哪些测试方法。通常,在强制降解研究中应使用在稳定性研究中使用的测试方法,以及确定同一性,纯度,含量和监测杂质的方法。这些方法应提供可靠的数据(通过对主峰和杂质之间的选择性进行测量)以及足够的中间精度,并且能够(如果发生)检测到变化。下表中显示了评估降解途径的分析方法。
评估强制降解途径的分析方法示例
在强制降解过程中用于生物药物分析的常用方法示例包括外观(即颜色,透明度,颗粒物);活动测量;十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);微芯片凝胶电泳;体积排阻高效液相色谱法(SEC-HPLC)(例如,用于蛋白质含量和聚集体);反相高效液相色谱法(RP-HPLC)(例如,纯度和特定杂质);等电聚焦(IEF)/成像毛细管等电聚焦(iCE)/离子交换HPLC(IE–HPLC)(例如,脱酰胺形式);肽图、生物学活性以及理化分析(例如差示扫描量热法[DSC],圆二色性[CD]和荧光)。
文章来源:《中国生物制品学杂志》 网址: http://www.zgswzpxzz.cn/zonghexinwen/2020/1106/344.html